研究所報2004

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治療法決定のためのasparagine synthetase(ASNS) の発現量解析入野保・逢坂光彦・鬼頭敏幸* ＊滋賀県立小児医療センター・小児科

1．はじめに

リアルタイムPCR 法は高い定量性、再現性があり、方法も簡便なことから、臨床症例の遺伝子発現を検討するのに適している。この研究ではリアルタイムPCRによるasparagine synthetase (ASNS)遺伝子の発現量解析法を確立し、治療適応症例の診断や治療法選択に有用なデータのフィードバックを試みている。ASNSの発現定量の意義は、T-ALLや一部のAMLにおいて、この欠損あるいは低発現例があり、これらの症例に対してアスパラギナーゼによりアスパラギン枯渇、蛋白合成抑制、DNA合成阻害を引き起こし、アポトーシスを介して細胞死に導く治療法の有効性が報告されている。^{1), 2), 3)}。ASNSを発現している正常組織、骨髄中の正常前駆細胞には障害性がないため、選択毒性の強い薬剤である。

2．方法

　細胞株はK562、HL60、Molt-4、U937とより抽出したtotal RNAより合成したcDNAをテンプレートとし、リアルタイムPCRにて発現量の定量分析を行った。また、各細胞株のサイトスピン標本をASNSモノクローナル抗体により免疫染色を行い比較検討した。L-asparaginaseへの耐性についてはMTTアッセイにより検討した。また、8例の小児白血病症例についても同様の検討を行った。

3．結果

　ASNSおよびGAPDHの検量線は両者ともに6乗希釈レベルまで直線性が認められた。これは絶対量として10コピーまで検出できる計算になり、あらゆる材料のASNSの定量解析は充分可能と考えられた。
細胞株ではK562が最も発現が高く、Molt-4が最も低く、また免疫染色との相関性も認められた。これらの定量値は免疫染色の染色性とほぼ相関する。ASNS発現量が低いほどL-aspへの感受性が高かった。
臨床例8例についてもASNSのmRNA発現量とL-asparaginaseへの耐性を検討し強い相関が認められた。

4．考察と今後の展望

　リアルタイムPCRによるASNSのmRNA発現量解析はタンパク発現量を反映していた。免疫染色など定性的な方法と違い、定量化でき、その直線性に優れ感度も高かった。他法に比し手技が簡便であることも併せ、診断や治療法選択の指標として有用性が高いことを参考文献 4) としてまとめ発表した。今後は、Flow Cytometryによる細胞内AS蛋白の定量的解析法の確立を進めたい。

参考文献

1） Story, M.D., Voehringer, D.W., Stephens, L.C., and Meyn, R.E.: L-asparaginase kills lymphoma cells by apoptosis. Cancer Chemother Pharmacol 32, 129-33. 1993.
2） Bussolati, O., et. al.: Characterization of apoptotic phenomena induced by treatment with L-asparaginase in NIH3T3 cells. Exp Cell Res 220, 283-91.　1995.
3） Ueno, T., et. al: Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L-asparaginase. Leukemia 11, 1858-61. 1997.
4） Irino T, Kitoh T, Koami K, Kashima T, Mukai K, Takeuchi E, Hongo T, Nakahata T, Schuster SM, Osaka M. Establishment of real-time polymerase chain reaction method for quantitative analysis of asparagine synthetase expression. J Mol Diagn. 6, 217-224, 2004.

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