研究所報2002

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リアルタイムPCR法によるasparagine synthetase(ASNS) の発現量解析入野保・加嶋照美・逢坂光彦滋賀県立小児医療センター鬼頭敏幸

1．はじめに

　本来アスパラギンはヒト細胞中でasparagine synthetase(ASNS)の働きで、アスパラギン酸とグルタミンからATPの加水分解エネルギーを利用して合成され、体外から摂取しなければならない必須アミノ酸ではない。T-ALLや一部のAMLにおいてはこのASNSの欠損あるいは低発現例があり、これらの症例に対してアスパラギナーゼによりアスパラギン枯渇、蛋白合成抑制、DNA合成阻害を引き起こし、最終的にはアポトーシスを介して細胞死に導く治療法の有効性が報告されている。1）2）3）。正常組織、骨髄中の正常前駆細胞には障害性がなく、選択毒性の強い薬剤であると考えられている。これらの診断や治療法選択のために、リアルタイムPCRによるASNS遺伝子の発現量解析法を確立し、免疫染色との対比を行った。

2．方法

　細胞株はK562、HL60、Molt-4、U937と健常者の末梢血細胞より抽出したtotal RNAより合成したcDNAをテンプレートとし、リアルタイムPCRにて発現量の定量分析を行った。また、各細胞株および健常者末梢血のサイトスピン標本をASNSモノクローナル抗体により免疫染色を行い比較検討した。

3．結果

　ASNSおよびGAPDHの検量線は両者ともに6乗希釈レベルまで直線性が認められた。これは絶対量として10コピーまで検出できる計算になり、あらゆる材料のASNSの定量解析は充分可能と考えられる。細胞株ではK562が最も発現が高く、Molt-4が最も低く、また免疫染色との相関性も認められた。これらの定量値は免疫染色の染色性とほぼ相関する。健常者末梢血ではK562に比べ1/10程度の発現量であった。免疫染色の結果は顆粒球では発現がみられ、単球やリンパ球では陰性細胞が多く観察された。

4．考察と今後の展望

　リアルタイムPCRによるASNSのmRNA発現量解析はタンパク発現量を反映していることはもちろん、他の発現解析法に比べ定量性や直線性に優れ感度も高く、他法に比し手技が簡便であることも併せ、診断や治療法選択の指標として有用性が高い。今後は臨床症例についても詳細に検討していきたい。

参考文献

1） Story, M.D., Voehringer, D.W., Stephens, L.C., and Meyn, R.E.: L-asparaginase kills lymphoma cells by apoptosis. Cancer Chemother Pharmacol 32, 129-33. 1993.
2） Bussolati, O., et. al.: Characterization of apoptotic phenomena induced by treatment with L-asparaginase in NIH3T3 cells. Exp Cell Res 220, 283-91.　1995.
3） Ueno, T., et. al: Cell cycle arrest and apoptosis of leukemia cells induced by L-asparaginase. Leukemia 11, 1858-61. 1997.

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